ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀助力外用益生菌在特應性皮炎作用機制探索

「摘要」

副干酪乳桿菌是一種益生菌，對多種過敏性疾病具有積極作用，并可通過調(diào)節(jié)免疫發(fā)揮作用，其中樹突狀細胞是其關(guān)鍵靶標之一。

2025年7月，麻布大學獸醫(yī)藥理學實驗室的Mao Kaneki等研究團隊在Preprints.org預印本平臺發(fā)表了一篇題為“Topical Administration of a Mixed Microbial Culture of Lactobacillus paracasei, Pichia membranifaciens and Saccharomyces cerevisiae Significantly Inhibits the Development of Atopic Dermatitis in a Mouse Model Through IL-10 over Expression by Dendriti"的文獻。

該研究采用混合微生物培養(yǎng)物LS（含副干酪乳桿菌、膜狀畢赤酵母和釀酒酵母），通過特應性皮炎小鼠模型，評價LS經(jīng)皮膚給藥的影響效果。方法上，利用小鼠樹突狀細胞系檢測IL-10和TNFα水平以評估免疫調(diào)節(jié)作用；在刺激的人表皮角質(zhì)形成細胞中，通過IL-8和胸腺細胞因子的產(chǎn)生評價抗炎效應。在AD小鼠模型中，局部使用10% LS軟膏，每周記錄臨床癥狀、背部皮膚厚度及經(jīng)表皮水分流失，并在尸檢后分析耳淋巴結(jié)的免疫反應。結(jié)果顯示，LS處理增強了DC2.4細胞分泌IL-10和TNFα的能力，同時降低了刺激的HaCaT細胞產(chǎn)生IL-8和TARC。在治療組中，癥狀、皮膚厚度或TEWL未見明顯改變，但局部淋巴結(jié)中IgE陽性B細胞數(shù)量和IL-4水平有所下降。預防性涂抹LS減輕了AD癥狀。結(jié)果表明，LS通過免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用能阻止AD的發(fā)展。 

實驗材料與儀器

材料

LS培養(yǎng)物、小鼠樹突狀細胞系、培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素、DAPI染色劑、多種單克隆抗體、心浸液瓊脂、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、小鼠T-激活劑CD3/CD28磁珠。

實驗動物：小鼠

儀器

ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀、CellDrop細胞計數(shù)系統(tǒng)、BD FACSAria III細胞分選儀、酶聯(lián)免疫吸附測定相關(guān)檢測設備。

ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀

「實驗過程」

本研究實驗分為體外實驗和體內(nèi)實驗兩部分，同時對實驗數(shù)據(jù)進行專業(yè)統(tǒng)計分析，具體過程如下：

體外實驗：驗證LS的免疫調(diào)節(jié)與抗炎作用

1. 樹突狀細胞實驗：將70%融合度的DC2.4細胞以1×10?個/100μL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，分別暴露于0、0.125、0.25、0.5、1mg/mL濃度的LS中，通過ELISA試劑盒定量檢測細胞上清液中IL-10和TNFα的濃度。

2. 角質(zhì)形成細胞實驗：將70%融合度的HaCaT細胞以1×10?個/100μL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)重組人TNFα和IFNγ刺激1h后，加入含0、0.125、0.25、0.5、1mg/mL LS的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24h，通過ELISA試劑盒定量檢測細胞上清液中IL-8和TARC的濃度。

體內(nèi)實驗：探究LS經(jīng)皮給藥對AD小鼠模型的治療與預防作用

1. AD小鼠模型構(gòu)建：對NC/Nga小鼠經(jīng)皮致敏Biostir AD，構(gòu)建特應性皮炎小鼠模型。

2. 治療性給藥實驗：在AD模型建立后的第19天（小鼠平均AD評分為2.07）開始給藥，實驗組每日經(jīng)皮涂抹0.1mL/只的10% LS溶液，對照組每日經(jīng)皮涂抹等體積去離子水，實驗期間每周監(jiān)測小鼠的AD評分、背部皮膚厚度、TEWL；實驗結(jié)束后收集小鼠耳淋巴結(jié)樣本，制備單細胞懸液并計數(shù)，通過細胞分選儀分析免疫細胞亞群，通過磁珠刺激T細胞后采用ELISA檢測細胞因子水平，同時對小鼠皮膚樣本進行盲法半定量組織病理學評估。

3. 預防性給藥實驗：設置AD對照組和LS預防性處理組，對LS組小鼠提前進行10% LS溶液經(jīng)皮給藥，后續(xù)監(jiān)測指標、樣本檢測與分析方法與治療性給藥實驗一致。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

體外實驗采用方差分析結(jié)合鄧尼特多重比較檢驗；體內(nèi)實驗采用雙因素方差分析結(jié)合?ídák多重比較檢驗或?qū)W生t檢驗，以5%為概率水平判定統(tǒng)計明顯性，所有數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 10分析，結(jié)果以平均值±標準誤表示。

「實驗結(jié)論」

副干酪乳桿菌、膜畢赤酵母和釀酒酵母的混合微生物培養(yǎng)物（LS）具備免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。在體外培養(yǎng)中，LS能促進小鼠樹突狀細胞系DC2.4分泌IL-10和TNFα，并劑量依賴性地抑制經(jīng)TNFα/IFNγ刺激的人表皮角質(zhì)形成細胞系HaCaT產(chǎn)生IL-8和TARC。在AD小鼠模型中，治療性給藥未改善小鼠的臨床癥狀、皮膚厚度和經(jīng)表皮失水量，但改善了皮膚角化層增生、表皮痂皮等組織病理學特征，同時降低了局部淋巴結(jié)中IgE陽性B細胞數(shù)量和IL-4水平；而預防性給藥效果更明顯，降低了AD臨床評分，改善了皮膚組織病理學特征，并減少了局部淋巴結(jié)中的效應T細胞數(shù)量和IL-13水平。整體而言，LS通過免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，能夠有效預防特應性皮炎的發(fā)生發(fā)展。

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