VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x助力雪腐鐮刀菌加劇小鼠特應(yīng)性皮炎的研究

2024年4月麻布大學(xué)的Tomoki Fukuyama研究團(tuán)隊(duì)在《Archives of Toxicology》（IF=6.9）期刊上發(fā)表了一篇題為“Sub-acute oral exposure to lowest observed adverse effect level of nivalenol exacerbates atopic dermatitis in mice via direct activation of mitogen-activated protein kinase signal in antigen-presenting cells"的文獻(xiàn)。研究聚焦于B型單端孢霉烯族真菌毒素——雪腐鐮刀菌烯醇的免疫毒性，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探究了亞急性經(jīng)口暴露于觀察有害作用水平的NIV對(duì)特應(yīng)性皮炎的影響及分子機(jī)制，明確了NIV通過直接激活抗原呈遞細(xì)胞中的絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路加劇小鼠特應(yīng)性皮炎的作用機(jī)制。

摘要

本研究利用抗原呈遞細(xì)胞和特應(yīng)性皮炎小鼠模型，探究了真菌毒素雪腐鐮刀菌烯醇的免疫毒性作用。體外實(shí)驗(yàn)采用小鼠巨噬細(xì)胞系和小鼠樹突狀細(xì)胞系，將細(xì)胞暴露于0.19-5 µmol/L的NIV中24小時(shí)后，對(duì)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生量進(jìn)行定量分析。為進(jìn)一步探究炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生通路，通過MAPK抑制劑和磷酸化分析，研究了ERK1/2、p-38和JNK等絲裂原活化蛋白激酶通路在NIV暴露中的可能作用。此外，在半抗原誘導(dǎo)的AD模型中，評(píng)估了低濃度NIV經(jīng)口暴露的促炎效應(yīng)。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NIV暴露增強(qiáng)了TNFα的產(chǎn)生，且直接誘導(dǎo)了MAPK的磷酸化——MAPK抑制劑預(yù)處理后TNFα產(chǎn)生受到抑制，證實(shí)了這一通路的參與。與溶劑對(duì)照組相比，NIV經(jīng)口暴露加劇了AD癥狀，包括耳淋巴結(jié)中輔助性T細(xì)胞和產(chǎn)生IgE的B細(xì)胞數(shù)量明顯增加，以及IL-4、IL-5和IL-13等促炎細(xì)胞因子的分泌增強(qiáng)。研究結(jié)果表明，NIV暴露直接增強(qiáng)了ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，導(dǎo)致抗原呈遞細(xì)胞中TNFα產(chǎn)生增加，這與特應(yīng)性皮炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料

雪腐鐮刀菌烯醇、二甲基亞砜、丙酮、培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、混合液、抗磷酸化ERK、抗ERK、抗磷酸化p-38、抗p-38、抗磷酸化JNK、抑制劑、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、滅菌大麥培養(yǎng)基、10%福爾馬林溶液、蘇木精-伊紅染色液、革蘭氏染色液等。

細(xì)胞系：小鼠樹突狀細(xì)胞系、小鼠巨噬細(xì)胞系。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7周齡雌性NC/Nga小鼠。

實(shí)驗(yàn)儀器

96孔/12孔培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)、SDS-PAGE電泳裝置、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、蛋白成像系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x、細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)、珠磨式均質(zhì)器、石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)。

ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x

實(shí)驗(yàn)過程

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1. 細(xì)胞培養(yǎng)與NIV暴露：DC2.4細(xì)胞接種于含10% FCS和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，RAW264.7細(xì)胞接種于含相同添加劑的DMEM培養(yǎng)基，均在適宜條件下培養(yǎng)至70%匯合度。將兩種細(xì)胞（1×10?細(xì)胞/100 μL）接種到96孔或12孔板，分別暴露于0.19-5 µmol/L的NIV中，培養(yǎng)2、4或24小時(shí)，提前進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)確認(rèn)無(wú)細(xì)胞毒性。

2. 炎癥細(xì)胞因子檢測(cè)：培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNFα的分泌水平，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

3. 促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)分析：采用NucleoSpin® RNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA（500 ng），經(jīng)PrimeScript™ RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNFα的基因表達(dá)水平（采用2?ΔΔCt法計(jì)算）。

4. MAPK磷酸化檢測(cè)：NIV暴露2小時(shí)后，采用M-PER™試劑提取細(xì)胞總蛋白（10-30 µg），經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入一抗（抗磷酸化ERK、p-38、JNK等）和二抗孵育，通過ImmunoStar® Zeta試劑顯色，利用蛋白成像系統(tǒng)檢測(cè)并定量磷酸化蛋白水平。

5. MAPK抑制劑實(shí)驗(yàn)：在NIV暴露前1小時(shí)，向細(xì)胞中加入1 µmol/L的ERK1/2、p38或JNK抑制劑預(yù)處理，培養(yǎng)24小時(shí)后通過ELISA檢測(cè)TNFα的產(chǎn)生量，驗(yàn)證MAPK通路的作用。

體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1. AD小鼠模型建立與NIV暴露：實(shí)驗(yàn)第1周，將5% TDI的丙酮溶液局部涂抹于脫毛的小鼠背部皮膚和耳廓進(jìn)行致敏；隨后4周內(nèi)，每周局部涂抹0.5% TDI進(jìn)行激發(fā)。同時(shí)，通過飲用水每日給予小鼠1 ppm、5 ppm NIV（為驗(yàn)證重現(xiàn)性和中間濃度效應(yīng)，額外設(shè)置2.5 ppm NIV組）。

2. 皮膚相關(guān)指標(biāo)監(jiān)測(cè)：實(shí)驗(yàn)期間每周檢測(cè)一次經(jīng)皮水分流失（TEWL）、耳和背部皮膚厚度，采用0-4分制評(píng)估AD癥狀（0分為無(wú)癥狀，4分為極嚴(yán)重癥狀）。

經(jīng)表皮水分流失（TEWL）

3. 樣本收集：致敏4周后，收集小鼠背部皮膚、耳淋巴結(jié)（LN）和血清樣本。

4. 免疫細(xì)胞分析：制備耳淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液，經(jīng)小鼠Fc封閉劑處理后，加入特異性單克隆抗體孵育，通過流式細(xì)胞儀分析CD11c?CD40?樹突狀細(xì)胞、CD3?CD4?輔助性T細(xì)胞、CD19?IgE? B細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量。

5. 細(xì)胞因子與IgE檢測(cè)：將淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液（5×10?細(xì)胞/孔）與Dynabeads小鼠T細(xì)胞激活劑CD3/CD28共孵育24或96小時(shí)，通過ELISA檢測(cè)上清液中IL-4、IL-5和IL-13的水平；采用ELISA試劑盒測(cè)定血清總IgE水平。

6. 組織病理學(xué)評(píng)估：將皮膚樣本固定于10%福爾馬林溶液，石蠟包埋后切成5 μm切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色或革蘭氏染色，采用盲法按0-3分制（0為正常，3為嚴(yán)重）評(píng)估表皮增生、結(jié)痂、細(xì)胞浸潤(rùn)、潰瘍等病理變化。

7. 皮膚組織RNA分析：采用珠磨式均質(zhì)器破碎冷凍皮膚組織，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-4、IL-5和IL-13的基因表達(dá)水平（以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參）。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，多組間比較采用方差分析后進(jìn)行Dunnett多重比較檢驗(yàn)，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以p<0.05和p<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用GraphPad Prism 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 體外實(shí)驗(yàn)中，NIV暴露對(duì)DC2.4細(xì)胞的IL-1β和IL-6產(chǎn)生無(wú)明顯影響，但增強(qiáng)了DC2.4和RAW264.7細(xì)胞中TNFα的產(chǎn)生及基因表達(dá)；5 μmol/L NIV可增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的IL-1β產(chǎn)生，但對(duì)其IL-6的產(chǎn)生和基因表達(dá)無(wú)影響。

2. NIV暴露以劑量依賴方式誘導(dǎo)DC2.4細(xì)胞中ERK1/2、p-38和JNK的磷酸化，且特異性MAPK抑制劑可抑制NIV誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生，證實(shí)NIV通過激活MAPK通路促進(jìn)促炎細(xì)胞因子分泌。

3. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，5 ppm NIV經(jīng)口暴露增加了AD模型小鼠耳淋巴結(jié)中2型常規(guī)樹突狀細(xì)胞數(shù)量，輔助性T細(xì)胞和IgE陽(yáng)性B細(xì)胞數(shù)量呈增加趨勢(shì)；同時(shí)增強(qiáng)IL-4、IL-5和IL-13等Th2相關(guān)促炎細(xì)胞因子的分泌，但對(duì)血清總IgE水平無(wú)明顯影響；2.5 ppm NIV組也呈現(xiàn)類似的樹突狀細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放增強(qiáng)效應(yīng)。

4. 5 ppm NIV暴露加劇了小鼠AD癥狀，增加皮膚厚度和經(jīng)皮水分流失，皮膚組織病理學(xué)顯示表皮結(jié)痂、非角化層增生和潰瘍癥狀加重；2.5 ppm NIV暴露可增加經(jīng)皮水分流失，但對(duì)耳皮膚厚度無(wú)明顯影響；NIV暴露對(duì)皮膚組織中IL-4、IL-5和IL-13的基因表達(dá)無(wú)明顯影響。

5. 核心結(jié)論：NIV暴露通過直接激活抗原呈遞細(xì)胞中的ERK1/2、p-38和JNK MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)TNFα產(chǎn)生，進(jìn)而增強(qiáng)局部免疫炎癥反應(yīng)，最終加劇特應(yīng)性皮炎癥狀，提示NIV可能是特應(yīng)性皮炎發(fā)生發(fā)展的潛在風(fēng)險(xiǎn)因子。

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